每天3个剂量各测定6次


2.2.6方法学考察

2.2.6.1线性回归方程和线性范围

空白血清稀释混合对照品溶液(各标准品浓度均为0.25g/L)，基于药物浓度为0.25、血清0.05、药物药材0.01、化学0.005、不地棱的含定0.001、同产0.0005g/L，入血取上述系列混合对照品血清溶液，成分按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积。量测以横坐标(X)代表血清中药物的基于质量浓度，纵坐标(Y)代表药物与内标的血清峰面积比值，计算4种成分的药物药材回归方程和相关系数。

图1

2.2.6.2日间精密度和日内精密度试验

大鼠空白血清18份各100μL，化学不同质量浓度的不地棱的含定对照品溶液加入后在线性范围内配成低(0.0005g/L)、中(0.005g/L)、同产高(0.25g/L)3种待测液各6份，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积。每天3个剂量各测定6次，记录峰面积，计算日内精密度;1周内连续检测6d，计算日间精密度。

2.2.6.3方法回收率试验

分别配制6份低、中、高浓度的血清样本，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积，对照品峰面积与内标物峰面积的比值计算后测定质量浓度。将各成分理论的加入浓度和测定质量浓度进行比较，计算方法回收率。

2.2.6.4基质效应试验

分别配制6份低、中、高质量浓度的血清样本，按照标准处理后进行HPLC检测并记录色谱图和峰面积;同时配制相同浓度的以流动相为基质的对照品溶液直接进样分析，空白血清加对照品的测定值与对照品溶液测定值之比即为基质效应，考察血浆基质干扰情况。

2.2.6.5稳定性试验

分别配制18份低、中、高质量浓度的血清样本，取3种质量浓度样品各6份，在室温下放置4h，按照“2.2.4”项下方法处理得到待测血清样本，每个质量浓度的血清样本处理完成后进行HPLC检测;取三种质量浓度的样本各6份，－20℃条件下将含药血浆样本冷冻24h，室温下再溶解，反复冻融3次后进行HPLC检测;另将于－80℃条件将3种质量浓度的样本各5份放置1周，待室温溶解后进行HPLC检测。计算3种条件下的标准偏差(ＲSD)，考察稳定性。

2.2.7统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差(x±s)表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析(One－wayANOVA)中的LSD法(最小显著性法)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.2.8结果与分析

2.2.8.1专属性试验

结果如图1所示，按照标准处理的大鼠空白血清进行HPLC检测后，空白血清中的香草酸、对羟基苯甲酸、芦丁及阿魏酸对照品及内标物与内源性物质的分离度良好，且没有干扰物质，各药品及代谢物与内源性物质之间没有相互作用，显示该方法专属性良好。

2.2.8.2线性回归方程和线性范围

血清中对羟基苯甲酸的回归方程为Y=56971.00X+282.99(Ｒ2=0.9998)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好;香草酸的回归方程为Y=36756.00X+247.66(Ｒ2=0.9997)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好;阿魏酸的回归方程为Y=50686.00X+89.41(Ｒ2=0.9998)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好;芦丁的回归方程为Y=36349.00X+20.99(Ｒ2=0.9997)，在质量浓度0.0005～0.25g/L范围内线性关系良好。按信噪比(S/N)为3来计算，对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁的最低检测限均为是0.0001g/L。

2.2.8.3回收率、精密度、稳定性和基质效应结果


计算得到各组含药血浆样本的方法回收率＞90%，精密度ＲSD＜10%，各组样品稳定性均ＲSD＜10%，基质效应考察结果在89.53%～95.12%;结果显示实验精密度良好，稳定性及回收率均符合药动学的要求。

2.2.9基于血清药物化学研究不同产地三棱的血中成分测定

根据HPLC条件，对中药三棱干预后的大鼠血浆样品进行测定。以给药时间为横坐标，以相对峰面积为纵坐标，计算各成分的含量，结果显示在连续给予大鼠中药三棱7d后，于末次给药1h后，三棱的药效物质对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁达到峰值。具体结果见表2。

表2

3讨论

通过对三个不同产地三棱药材中的化学成分分析及入血成分研究，进行色谱比较，确定原型成分及代谢产物为对羟基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、芦丁。同时可见不同产地三棱药材四种成分体外和入血含量各不相同。药材提取物中对羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸以浙江产地较高，芦丁以江苏产地略高;入血成分中芦丁、对羟基苯甲酸以安徽产地较高，阿魏酸、香草酸以江苏产地略高。所有成分均在1h左右达到峰值。

由于各地栽培的土壤、气候等差异，药材提取物中有效成分含量不同，而吸收入血的成分含量也有所不同。入血成分直接决定药效，所以给药后取含药血清进行分析，分析鉴定血清中移行成分，研究其药效相关性，对确定中药的药效物质基础尤为关键，可为建立合理的中药质量控制模式和方法提供参考。本研究可为三棱的资源综合利用和质量控制提供实验依据。

声明：本文所用图片、文字来源《中国中医药科技》2020年7月第27卷第4期，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

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